A necessidade de água ‘isenta de nuclease’ em aplicações de PCR é amplamente reconhecida

As técnicas de PCR são amplamente utilizadas no setor de ciências da vida para amplificação de material genético, desde pesquisas genômicas fundamentais até aplicações biomédicas e forenses avançadas. A necessidade de reagentes e soluções livres de nucleases (DNase, RNase) que possam causar a degradação de oligonucleotídeos é amplamente reconhecida. No entanto, a influência de outros contaminantes transmitidos pela água é raramente considerada. Isso pode causar problemas nos resultados do teste, por isso é vital que a água seja usada livre de contaminantes transmitidos pela própria água.

O advento da reação em cadeia da polimerase (PCR)

As técnicas revolucionaram a genômica no início dos anos 80 e os métodos baseados em PCR, como PCR de transcrição reversa (RT-PCR) e PCR quantitativo (qPCR), agora são essenciais em uma ampla gama de aplicações de pesquisa médica e biológica.

A amplificação de DNA por PCR depende do uso de enzimas polimerase de DNA para sintetizar moléculas de DNA de cadeia dupla a partir de ‘modelos’ de fita simples, usando sequências iniciadoras de oligonucleotídeo curtas para atingir o gene de interesse. Embora esse processo geralmente use polimerases de DNA termoestáveis, tanto a especificidade do alvo quanto a eficiência da reação catalisada por enzima são altamente dependentes das condições físicas (pH, temperatura, etc.) e composição da mistura de reação1.

A presença de nucleases – enzimas que cortam as ligações fosfodiéster entre subunidades de ácidos nucleicos – dentro do vaso de reação levará a uma grave interrupção do processo de PCR, pois o material genético rapidamente se fragmentará sob condições de reação. Portanto, é vital garantir que todos os reagentes e soluções usados ​​em aplicações de PCR estejam livres de nucleases. A necessidade de água ‘isenta de nuclease’ em aplicações de PCR é amplamente reconhecida; no entanto, existem vários outros contaminantes comumente encontrados na água que podem impedir a amplificação do DNA2 por PCR, incluindo:

Bactérias

A presença de DNA bacteriano pode levar a resultados errôneos, particularmente para técnicas de qPCR, bem como à amplificação de sequências não objetivas. Além disso, muitas bactérias liberam nucleases extracelulares e outras pequenas moléculas e íons que interferem na polimerização do DNA.

Íons

As polimerases de DNA termoestáveis ​​requerem um co-fator de magnésio (Mg2 +) para uma ligação eficaz ao substrato. O Mg2 + é, portanto, crucial para a otimização da atividade da polimerase3. As enzimas da polimerase também são altamente sensíveis a outros cátions divalentes comuns (Cu2 +, Fe2 +, Ni2 +, etc.), que interferem na coordenação do co-fator e interrompem a ligação do substrato no local ativo. Além disso, a presença de quantidades vestigiais de íons de metais pesados ​​(como o cádmio) inibirá a atividade enzimática

Compostos orgânicos

As partículas podem causar danos à bomba de HPLC e também podem bloquear colunas e capilares. Esse efeito é ainda mais significativo para usuários de UHPLC, pois os tamanhos de partículas muito pequenas e os diâmetros reduzidos dessas colunas os tornam mais suscetíveis ao bloqueio prematuro do que seus colegas de HPLC. Os coloides podem ser adsorvidos irreversivelmente na fase de papelaria, resultando em uma alteração na eficiência de separação da coluna.

Radiação ultravioleta (UV)

Como as moléculas de DNA carregam uma carga negativa, outras biomoléculas carregadas negativamente no ambiente de reação podem interferir na ligação do substrato ao entrar no local ativo carregado positivamente e causar interferência estérica, levando a uma menor rotatividade do substrato.

Água purificadora para PCR

A otimização dos processos de PCR requer o uso de água livre de nucleases, microrganismos, compostos orgânicos e oligoelementos para a constituição de todos os reagentes e tampões. Para garantir que esses contaminantes não estejam presentes, a água ultrapura (Tipo I) – com resistividade de 18,2 MΩcm, baixo valor de carbono orgânico total (TOC) inferior a 10 ppb, níveis de bactérias abaixo de 1 UFC/ml e endotoxinas abaixo 0,01 EU/ml – é altamente recomendado para aplicações de PCR.

Os Purelab Chorus Life Science da Elga usam um processo de purificação em várias etapas para produzir água de grau reagente adequada para PCR, incluindo:

Radiação ultravioleta (UV)

A passagem de água através de um feixe de luz ultravioleta efetivamente quebra os compostos orgânicos, incluindo bactérias e moléculas bioativas, como nucleases e endotoxinas. Um comprimento de onda de 185 nm oxida as macromoléculas contendo carbono, produzindo fragmentos ionizados para remoção subsequente por troca iônica, enquanto a radiação UV de comprimento de onda maior (254 nm) interrompe a atividade de enzimas bacterianas, impedindo a replicação. Para maximizar a quebra de moléculas orgânicas, o Purelab Ultra Chorus Life Science usa uma lâmpada UV de espectro total com uma luva de quartzo sintético de altíssima pureza.

Figura 1. Eficiência germicida da radiação UV

Ultrafiltração

Os ultrafiltros (UFs) são dispositivos feitos de fibras ocas capilares, com corte nominal de peso molecular de 5 KDa. Essas fibras são geralmente assimétricas, as quais maximizam a remoção de macromoléculas pelo diferencial de peso molecular, tendo em vista que essas macromoléculas têm peso molecular superiores a 5KDa

O Purelab Chorus Life Science da Elga usa cartuchos de purificação de alta capacidade de remoção iônica combinados com a lâmpada UV e o ultrafiltro, para fornecer de forma confiável água ultrapura e livre de endotoxinas (ver tabela).

A resistividade e o TOC em em tempo real garantem o monitoramento confiável de contaminantes orgânicos e inorgânicos e o sistema oferece rastreabilidade validada e qualidade garantida da Elga Veolia.

Tabela 1. Eficiência na remoção de endotoxinas

O Purelab Chorus Life Science foi aplicado numa amostra de 25 litros de água ultrapurificada com 10.000 EU / ml de endotoxinas, atingindo um nível residual de endotoxina <0,001 EU / ml, mesmo após o vigésimo quinto litro ultrafiltrado.

Em conclusão, água ultrapura com alta resistividade (18,2 MΩcm) e isenta de endotoxinas  deve ser usada para todas as aplicações de PCR, garantindo a amplificação otimizada das sequências alvo. Bem como dispensar o tempo perdido com autoclavação nos protocolos clássicos para inativação das endotoxinas.

Referências

1. Bogetto, P et al. (2000). Helpful tips for PCR. Focus, 22 (1), 12.

2. Sambrook, J and Russel, DW (2001). Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed).

3. Yang, L et al. (2004). Critical role of magnesium ions in DNA polymerase beta’s closing and active site assembly, J Am Chem Soc, 126 (27), 8441-8453.

4. ASTM “ Standard Guide for Bio-applications Grade Water”, D 5196-06.

Tags:

água, ciências da vida, Purelab Chorus Life Science, técnicas de PCR

Compartilhe: