Grupo da Unicamp associa espectrometria de massas, cromatografia líquida bidimensional e mobilidade iônica para estudar a proteômica de células cerebrais possivelmente envolvidas na esquizofrenia

Em um estudo com resultados recentemente publicados na revista Proteomics, com destaque na capa do periódico, o grupo de Martins-de-Souza otimizou um método para aumentar a resolução das análises proteômicas por espectrometria de massas.

Um dos principais desafios na área de proteômica – ciência que busca identificar o conjunto de proteínas presente em amostras biológicas – é conseguir discriminar moléculas que, apesar de serem estruturalmente diferentes, apresentam a mesma massa.

Isso porque o principal equipamento usado nesse tipo de estudo – o espectrômetro de massas – funciona como uma balança molecular, ou seja, ele separa as moléculas analisadas de acordo com a massa.

Uma das formas de reduzir confusões dentro do aparelho é submeter previamente a amostra a técnicas como a cromatografia líquida, capaz de separar as proteínas que gostam de água (hidrofílicas) das que não gostam (hidrofóbicas). As hidrofílicas entram primeiro no espectrômetro e as mais hidrofóbicas ficam por último, diminuindo a chance de duas moléculas diferentes de massa equivalente serem lidas pelo equipamento como uma coisa só.

“É como montar um quebra-cabeça de milhões de peças. Quando você abre o saco pela primeira vez, as peças estão misturadas e sobrepostas. O primeiro passo é separá-las. Nós, que trabalhamos com proteômica, estamos sempre tentando aperfeiçoar as técnicas para fazer essa separação”, disse Daniel Martins-de-Souza, coordenador do Laboratório de Neuroproteômica da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

Em um estudo com resultados recentemente publicados na revista Proteomics, com destaque na capa do periódico, o grupo de Martins-de-Souza otimizou um método para aumentar a resolução das análises proteômicas por espectrometria de massas. Graças à união de outras duas técnicas – cromatografia líquida bidimensional e mobilidade iônica – a equipe da Unicamp conseguiu identificar 10.390 proteínas expressas em oligodendrócitos, as células do sistema nervoso central responsáveis pela produção de mielina, uma substância lipídica fundamental para a troca de informação entre neurônios.

Em um trabalho anterior, no qual foi usada apenas a cromatografia líquida unidimensional para fazer a separação prévia, o grupo havia identificado nesse mesmo tipo celular apenas 2.290 proteínas.

“Agora, temos um banco de dados bem mais completo das proteínas de oligodendrócitos e isso vai ser útil tanto para nossos estudos quanto para outros pesquisadores da área. Os dados estão disponíveis on-line e podem ser baixados. Além disso, essa técnica de otimização pode ser aplicada para estudar o proteoma de qualquer amostra biológica de interesse”, disse Martins-de-Souza.

Com apoio da FAPESP, o grupo da Unicamp vem há alguns anos estudando o proteoma dos oligodendrócitos com o objetivo de compreender melhor as causas da esquizofrenia e, desse modo, propor novas abordagens terapêuticas.

Segundo Martins-de-Souza, os tratamentos hoje disponíveis têm como foco os neurônios. No entanto, na avaliação do pesquisador, as falhas na comunicação neuronal observadas em portadores de esquizofrenia podem ser uma consequência de disfunções nos oligodendrócitos.

“Uma de nossas linhas de pesquisa é avaliar como os medicamentos usados contra a doença modificam o proteoma dos oligodendrócitos. Com essa nova metodologia, poderemos obter cinco vezes mais informação sobre o papel desses fármacos”, afirmou.

O trabalho foi desenvolvido durante o pós-doutorado de Juliana Silva Cassoli e o mestrado de Caroline Brandão Teles – ambas bolsistas da FAPESP e orientandas de Martins-de-Souza.

Como funciona

O primeiro passo das análises proteômicas baseadas em espectrometria de massas é quebrar as proteínas extraídas da amostra biológica de interesse, no caso o oligodendrócito, em partículas menores chamadas peptídeos.

“Uma proteína pequena pode dar origem a pelo menos 10 peptídeos diferentes. O espectrômetro tem dificuldade para lidar com a molécula inteira por ser muito grande”, explicou Martins-de-Souza.

Em seguida, o grupo submeteu a amostra à separação por cromatografia. Mas, em vez de usar uma única matriz, como na técnica convencional, foram usadas duas. Desse modo, ocorre uma primeira separação, na qual apenas um quinto dos peptídeos injetados sai para o espectrômetro na forma líquida. Depois ocorre uma segunda etapa de separação, na qual sai o segundo quinto e assim sucessivamente.

“É como se antes estivéssemos espalhando as peças do quebra-cabeça com apenas uma mão e, agora, estivéssemos usando as duas”, disse o pesquisador.

Dentro do espectrômetro, a amostra é transformada em gás e voa de um lado para outro sob vácuo. Quanto menor for o peptídeo, mais rapidamente ele chega ao destino e, assim, o equipamento calcula a massa.

Nesse momento em que as moléculas estão voando dentro do espectrômetro entra em ação a técnica de mobilidade iônica. Por meio de um tubo, um pouco de gás é injetado dentro do aparelho.

“A resistência que cada molécula oferece ao gás depende de sua forma tridimensional. Portanto, se houver dois peptídeos diferentes de mesma massa voando juntos e jogarmos um vento na direção contrária, a tendência é que ocorra uma separação pela força de resistência ao gás. É como pegar duas folhas de papel de mesma massa e amassar uma delas apenas. Por causa da forma, aquela que está amassada chegará mais rápido ao chão”, explicou Martins-de-Souza.

Ao final do experimento, os mais de 223 mil peptídeos identificados pelo espectrômetro foram reconstruídos por meio de ferramentas de bioinformática – dando origem às 10.390 proteínas descritas no trabalho. O grupo também mapeou, por meio de bioinformática, os compartimentos celulares em que as proteínas são encontradas e os processos biológicos em que estão envolvidas.

“O ideal é que sejam identificados dois peptídeos por proteína, pelo menos. Assim, podemos ter certeza de que uma molécula está de fato presente na amostra, pois dificilmente encontramos duas proteínas com dois peptídeos exatamente iguais. Neste trabalho, cerca de 20% das proteínas foram identificadas por mais de 20 peptídeos”, contou o pesquisador.

Ainda segundo Martins-de-Souza, a metodologia permitiu identificar até mesmo proteínas pouco abundantes na amostra – em quantidade cerca de 10 milhões de vezes menor que as moléculas mais expressas.

“Um dos problemas da espectrometria de massas é que uma peça muito grande do quebra-cabeça pode esconder as menores. Mas com uma boa ferramenta para espalhar as peças torna-se possível ver praticamente todas elas”, disse. Com informações da Fapesp

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cromatografia líquida, espectrômetro de massas, proteômica

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