Por Luiz Carlos R. Moreno
Field Application Scientist Team Leader | Life Sciences & Technology, PerkinElmer
Caracterização das técnicas de imuno-histoquímica (IHC)
A técnica de imuno-histoquímica (IHC) é amplamente utilizada nas mais diversas áreas da ciência, por ser um método efetivo para pesquisa de antígenos, com o emprego de anticorpos específicos que podem ser visualizados através de coloração, em tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE: formalin-fixed, paraffin-embedded). Sua história tem início nos anos 40, quando Albert H. Coons demonstrou a viabilidade de localizar moléculas, especialmente microrganismos, em cortes de tecidos, utilizando anticorpos marcados com fluoresceína e visualizados através de um microscópio de fluorescência.
A partir da década de 1960, com a introdução de enzimas como anticorpos marcados e a possibilidade da visualização da interação entre antígeno e anticorpo, através de um microscópio óptico, a imuno-histoquímica se tornou a ferramenta padrão para indicar a existência de marcadores específicos em tecidos e passou também a se difundir em diferentes campos científicos. Por ser considerada uma técnica de fácil aplicação, confiável e versátil, nas últimas duas décadas, o número de publicações científicas utilizando a IHC cresceu exponencialmente de, ao redor de 1.000 artigos na década de 1980, para mais de 100.000, no início dos anos 2000.
No campo da patologia diagnóstica exerce papel fundamental para a caracterização de neoplasias. Na área da pesquisa do câncer, a imuno-histoquímica fornece um arcabouço de informações que atuam em fatores prognósticos de doença, avaliação da efetividade de novos tratamentos e a verificação da toxicidade de drogas terapêuticas em processo de desenvolvimento, tornando-se ainda mais importante no atual momento da pesquisa médica, por conta da irrestrita busca por metodologias de tratamentos personalizados.
São diversos, os benefícios da IHC que podem ser indicados, como a alta especificidade das reações, a localização dos antígenos pesquisados, a caracterização do contexto morfológico e da distribuição espacial dos antígenos, a avaliação semi-quantitativa do nível de expressão dos marcadores e, principalmente, apresentar in vitro as respostas biológicas in vivo.
Tecnologia TSATM: amplificação de sinal para ensaios imunológicos
A tecnologia de Amplificação de Sinal por Tiramida (TSA: Tiramyde Signal Amplification), patenteada pela PerkinElmer®, pode ser aplicada em diversos tipos de ensaios imunológicos e a única premissa para a sua aplicação é o uso da enzima HRP (Horsereadish Peroxidase), durante o processo, que catalisa a deposição de milhares de marcadores para detecção, próximos à proteína de interesse.
O TSA aumenta a sensibilidade em até duas ordens de magnitude (ou até mais), em relação às técnicas tradicionais e pode ser utilizado para detecções cromogênicas ou por fluorescência. São elencados os seguintes benefícios para esta metodologia:
– Redução do consumo de anticorpo primário, diminuindo o custo total do ensaio.
– Aumento da sensibilidade entre 10 a 100 vezes, sendo ideal para proteínas de baixa expressão ou ensaios associados a anticorpos de baixa afinidade.
– Resolução excelente e baixo background.
O processo de funcionamento do TSA é baseado na técnica de Deposição Catalisada de Reporters (CARD: Catalyzed Reporter Deposition), em imunoensaios de fase sólida. Na presença de pequenas quantidades do peróxido de hidrogênio, o HRP converte o reagente TSA marcado em uma molécula intermediária extremamente reativa. A molécula de TSA reativa reage rapidamente e se liga de forma covalente, em regiões adjacentes das proteínas-alvo, a resíduos de tirosina ou triptofano. A ligação da molécula ativa de tiramida somente ocorre em sites ao qual a enzima HRP está ligada. As moléculas de TSA reativo que não se ligaram ao complexo formam dímeros que são eliminados durante as etapas de lavagem.
A tecnologia de reagentes TSATM é uma metodologia estabelecida e amplamente difundida em diversas áreas da pesquisa como câncer, biologia do desenvolvimento, neurociência, entre outras áreas, onde o baixo nível da marcação pode ser um indicador de importantes processos celulares.
Tecnologia OPALTM: ensaios com múltiplos marcadores no mesmo tecido FFPE
Devido à característica da ligação covalente entre as moléculas de tiramida marcada e o complexo formado por antígeno, anticorpos e HRP, a tecnologia do TSATM abre a possibilidade para a caracterização multiplexada da amostra.
Além da redução do número de cortes seriados do tecido FFPE, necessários para a investigação de diferentes alvos, a adoção de ensaios multiplexados de IHC oferece benefícios singulares em relação ao método de simples marcação, como a contextualização espacial dos marcadores e avaliação da coexpressão celular individual na amostra, caracterização dos tipos celulares e heterogeneidade do microambiente histológico, monitoramento de vias de sinalização celular e preservação da arquitetura do tecido e relações celulares.
Entre os desafios para a execução de um ensaio de IHC multiplexada, um dos principais é a reatividade cruzada entre os anticorpos primários que, em geral, devem ser criados em espécies diferentes, além disso, algumas outras dificuldades podem ser indicadas, como sinal desbalanceado entre os marcadores, baixo range dinâmico, background e impedimento da revelação de alvos posteriores, após a detecção do primeiro.
De forma a atenuar as adversidades causadas na execução da IHC multiplexada e permitir ao usuário usufruir das significativas vantagens dessa metodologia, a PerkinElmer desenvolveu uma solução para ser aplicada em qualquer reação funcional de IHC e, assim, expandir a quantidade de informações fornecidas pelas amostras de tecido FFPE, a tecnologia OPALTM.
A tecnologia OPALTM é baseada na segunda geração de reagentes de amplificação: TSATM Plus, cujo princípio de funcionamento é o mesmo do TSATM, com a ocorrência de ligações covalentes de tiramida marcada apenas nas regiões imediatamente adjacentes aos sítios da proteína que a enzima ativada HRP está ligada, ademais apresenta componentes mais estáveis e aperfeiçoados, oferecendo maior sensibilidade, que chega a quase 20 vezes mais que o TSATM tradicional. Além disso, o TSATM Plus possibilita o uso do calor, como tratamento para retirada dos anticorpos primário e secundário presentes na amostra. Esta técnica viabiliza o uso de anticorpos primários de mesma espécie, para a detecção de vários antígenos, no mesmo tecido, pois elimina o efeito da reação cruzada, ao suprimir o complexo de anticorpos primário e secundário do marcador antecedente.
A coloração OPAL de até quatro cores pode ser facilmente visualizada em um microscópio de fluorescência, pois a combinação correta das cores e a configuração de filtros impedem o cross-talk entre os sinais, permitindo a inspeção visual do espécime, e a sua caracterização contextual, além das outras possibilidades já indicadas anteriormente.
OPALTM para IHC: possibilidades futuras
Ao associar a estabilidade e a capacidade de amplificação do TSATM Plus com a técnica de eliminação de anticorpos através do tratamento com micro-ondas, a tecnologia OPALTM traz para o âmbito da IHC a capacidade de realização de ensaios multiplexados, com a aplicação de diferentes fluoróforos incorporados à tiramida, permitindo a obtenção de resultados contextualizados do microambiente da amostra e, abrindo novas possibilidades de aplicação dos ensaios de IHC, como a avaliação das imagens, a partir do uso de câmeras multiespectrais e software com a capacidade de explorar as interações celulares, quantificar e classificar o fenótipo celular enquanto mantém o contexto do tecido.
O OPALTM faz parte das soluções phenopticsTM da PerkinElmer®, que além das estratégias de coloração, incluindo painéis multicoloridos para alguns tipos de câncer, oferece estações para aquisição de imagens multiespectrais configuradas com um impressionante software de análise que elimina a autofluorescência do tecido e cujo fundamento principal de análise é o desenvolvimento de algoritmos, através do aprendizado da máquina pelos padrões informados ao programa pelo usuário. PhenopticsTM da PerkinElmer se apresenta como a solução para a classificação fenotípica in situ de células imunológicas em tumor, em tecidos FFPE, apresentando dados quantitativos semelhantes aos obtidos pela metodologia de citometria de fluxo, no entanto, com a possibilidade de não apenas quantificar a média de expressão molecular em tecidos homogeneizados, mas também avaliar a distribuição espacial celular enquanto mantém-se as propriedades de arquitetura de células e tecido e desenvolver uma figura detalhada de todo o microambiente do tecido. Não são poucos os exemplos de notáveis referências na pesquisa de câncer (MD Anderson Cancer Center, Universidade da Califórnia, Universidade de Yale, Providence Cancer Center, entre outros), que têm se beneficiado das vantagens e informações singulares obtidas com o uso das soluções phenoptics.
Conheça as técnicas de Imuno-histoquímica Multiplexada OPALTM e as possibilidades de avaliação quantitativa e classificação fenotípica celular através das soluções phenopticsTM , da PerkinElmer®, clicando aqui.
Referências:
Bobrow MN, Harris TD, Litt GJ, Shaughnessy KJ. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. Journal of Immunological Methods. (1989); 125(1-2): 279-284
Brouns et al. Triple Immunofluorescence Staining with Antibodies Raised in the Same Species to Study the Complex Innervation Pattern of Intrapulmonary Chemoreceptors. The Journal of the Histochemistry & Cytochemistry. 2002; 50(4): 575-582
Galetta H, Mansfield J, Oguejiofor, KK, Richards B. Validation of multiplex immunofluorescence for use in analysis of tumour infiltrating lymphocytes. Journal for Immunotherapy of Cancer. (2015); 3 (Suppl 2): 411.
Hoyt CC, Roman KA, Stack EC, Wang C, Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods (2014); 70: 46-58
Kern JS, Schacht V. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology (2015); 135: 1-4.
Mansfield JR. Multispectral Imaging: A Review of Its Technical Aspects and Applications in Anatomic Pathology. Veterinary Pathology. (2014); 51(1): 185-210
Matos et al. Immunohistochemistry as an Important Tool in Biomarkers Detection and Clinical Practice. Biomarker Insights. 2010; 5: 9-20
Mezey E, Tóth ZE. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens With Tyramide Signal Amplification Using Antibodies From the Same Species. The Journal of the Histochemistry & Cytochemistry. (2007); 55(6): 545-554.
Ramos-Vara JA. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet. Pathology. (2005); 42: 405-426